O acervo de manuscritos - com cerca de 800.000 documentos, entre avulsos e encadernados - compreende o longo período que vai do século XI ao século XXI. Seu núcleo inicial é composto pelos manuscritos trazidos pela Família Real portuguesa em 1808, quando de sua vinda para o Brasil. A eles foram somados os documentos recolhidos pela Secretaria de Estado dos Negócios do Reino e, mais tarde, pela Secretaria de Estado dos Negócios do Império, ou Ministério do Império.

Com o tempo foram incorporados ao acervo outros conjuntos documentais que o alçaram à categoria de referência indispensável a pesquisadores em história e literatura, reunindo manuscritos em grego, latim, persa, português arcaico, clássico e contemporâneo, com os mais variados tipos de escrita, linguagem e papel.

Dentre seus muitos documentos notáveis, podem-se destacar os Livros de Horas iluminados, datados do período medieval; a Carta de abertura dos portos, assinada pelo então Príncipe regente do Brasil, o futuro D. João VI; as estampas da Coleção Alexandre Rodrigues Ferreira, que retratam a fauna, a flora e as populações do Brasil do século XVIII; por fim, os originais de poesias, contos e romances de autores como Machado de Assis, Coelho Neto, Lima Barreto e Lygia Fagundes Teles.

No esforço de facilitar o acesso a essas coleções, a Divisão de Manuscritos tem feito parceria com outras instituições de pesquisa, principalmente universidades, levando a cabo projetos de descrição e organização do acervo. Os documentos do período colonial são a prioridade, mas, nos últimos tempos, mais e mais coleções datadas do Império, da República e mesmo contemporâneas vêm sendo disponibilizadas através de catálogos e bases de dados.